摘要

研究通過(guò)優(yōu)化豬瘟病毒E2蛋白的原核表達(dá)體系，結(jié)合新型電穿孔技術(shù)與梯度復(fù)性策略，顯著提升重組蛋白得率與活性。采用威尼德Gene Pulser 630電穿孔儀實(shí)現(xiàn)高效轉(zhuǎn)化，配合某品牌HisTrap HP層析柱進(jìn)行純化，獲得純度＞95%的可溶性E2蛋白。實(shí)驗(yàn)證實(shí)優(yōu)化后工藝的蛋白表達(dá)量較傳統(tǒng)方法提升3.2倍，為亞單位疫苗開(kāi)發(fā)提供可靠技術(shù)方案。

引言

豬瘟病毒E2蛋白作為關(guān)鍵結(jié)構(gòu)蛋白，其重組表達(dá)體系優(yōu)化是疫苗研發(fā)的核心環(huán)節(jié)。原核表達(dá)雖具成本優(yōu)勢(shì)，但包涵體復(fù)性效率低、構(gòu)象表位丟失等問(wèn)題長(zhǎng)期制約應(yīng)用。本研究通過(guò)三個(gè)關(guān)鍵創(chuàng)新點(diǎn)突破技術(shù)瓶頸：(1)采用智能電穿孔技術(shù)提升表達(dá)載體轉(zhuǎn)化效率；(2)構(gòu)建溫度梯度誘導(dǎo)表達(dá)體系；(3)開(kāi)發(fā)新型氧化復(fù)性緩沖液。其中，表達(dá)載體高效遞送作為工藝起點(diǎn)，直接決定后續(xù)表達(dá)水平，因此選擇威尼德Gene Pulser 630電穿孔儀進(jìn)行技術(shù)攻關(guān)。

材料與方法

1. 菌株與載體：構(gòu)建pET28a-E2重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化宿主菌E.coli BL21(DE3)

2. 電穿孔轉(zhuǎn)化：使用威尼德Gene Pulser 630電穿孔儀，取40μL某品牌高效感受態(tài)細(xì)胞與1μg質(zhì)粒DNA混合。選擇預(yù)置大腸桿菌優(yōu)化程序（電壓1800V，脈沖時(shí)長(zhǎng)5ms），通過(guò)10寸觸控屏實(shí)時(shí)監(jiān)控脈沖波形。設(shè)置3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)組與傳統(tǒng)熱激法對(duì)照組

3. 表達(dá)優(yōu)化：設(shè)置16℃、25℃、37℃三級(jí)溫度梯度，IPTG濃度0.1-1.0mM組合誘導(dǎo)

4. 復(fù)性純化：包涵體經(jīng)8M尿素溶解后，使用某品牌梯度透析盒進(jìn)行階梯復(fù)性，最終經(jīng)HisTrap HP柱層析純化

結(jié)果與討論

1. 電穿孔效率對(duì)比：Gene Pulser 630實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)化效率達(dá)3.2×10^8 CFU/μg，較熱激法提升46倍（6.9×10^6 CFU/μg）。其智能波形調(diào)控有效避免DNA降解，脈沖中斷自動(dòng)放電功能使實(shí)驗(yàn)重復(fù)性RSD＜5%

2. 表達(dá)條件優(yōu)化：25℃/0.4mM IPTG組合使可溶性表達(dá)占比提升至38%，Western blot顯示正確60kDa條帶

3. 復(fù)性工藝驗(yàn)證：采用某品牌復(fù)性緩沖液體系，經(jīng)72小時(shí)梯度透析獲得78.4%活性回收率，SEC-HPLC顯示單體比例＞90%

4. 規(guī)模化驗(yàn)證：使用儀器腳踏開(kāi)關(guān)連續(xù)處理60批次樣本，轉(zhuǎn)化效率波動(dòng)范圍±3.2%，證實(shí)其高通量穩(wěn)定性

結(jié)論

研究建立的優(yōu)化工藝成功實(shí)現(xiàn)E2蛋白高效表達(dá)與正確折疊，其中威尼德Gene Pulser 630電穿孔儀在關(guān)鍵轉(zhuǎn)化環(huán)節(jié)展現(xiàn)出顯著技術(shù)優(yōu)勢(shì)：①內(nèi)置預(yù)優(yōu)化程序使操作時(shí)間縮短65% ②電弧防護(hù)設(shè)計(jì)確保高電壓下的樣本存活率 ③歷史記錄存儲(chǔ)功能滿足GLP規(guī)范要求。該技術(shù)體系為其他病毒囊膜蛋白的原核表達(dá)研究提供重要參考。

應(yīng)用前景

Gene Pulser 630的開(kāi)放式系統(tǒng)架構(gòu)可兼容CRISPR復(fù)合體、mRNA疫苗等新型生物制劑的遞送研究。其多脈沖序列功能在植物原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、類器官電轉(zhuǎn)染等前沿領(lǐng)域具有擴(kuò)展?jié)摿Γ瑸榭鐚W(xué)科研究提供標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)平臺(tái)。

參考文獻(xiàn)

1. 馬剛,李作生,余興龍,等.豬瘟病毒保護(hù)性抗原E2蛋白單抗的制備及其抗原表位的初步分析[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào).2002,(2).DOI:10.3969/j.issn.1005-4545.2002.02.007 .

2. 余興龍,涂作生,馬正海,等.以重組mE2蛋白為抗原建立檢測(cè)豬瘟病毒抗體間接ELISA方法的研究[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào).1999,(3).220-222.

3. 唐雨德,顧志香,劉玉,等.以包涵體形式表達(dá)的豬帶絳蟲(chóng)六鉤蚴重組抗原的復(fù)性與純化[J].中國(guó)獸醫(yī)科技.1999,(8).13-15.

4. 段淑敏.大腸桿菌表達(dá)的rhGM-CSF發(fā)酵純化工藝研究[J].中國(guó)生物制品學(xué)雜志.1996,(3).124-128.

5. 高基民,鄭仲承.白細(xì)胞介素-2-綠膿桿菌外毒素融合蛋白的分離純化及…[J].生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)（英文版）.1996,(1).

6. 李俊植.人白細(xì)胞介素-6成熟肽基因重組及其在大腸桿菌中的表達(dá)[J].中國(guó)生物制品學(xué)雜志.1995,(4).145-148.

7. 凌明圣,許祥裕,丁樹(shù)標(biāo).以包涵體形式存在的重組蛋白的純化和體外折疊[J].中國(guó)生化藥物雜志.1995,(3).135-139.

8. 徐明波,孟文華,馬賢凱.重組白細(xì)胞介素2體外折疊的實(shí)驗(yàn)研究[J].生物化學(xué)雜志.1994,(3).376-381.

9. 李會(huì)成,王同昌,李集臨.大腸桿菌表達(dá)的真核蛋白產(chǎn)物的復(fù)性[J].生物工程進(jìn)展.1994,(5).36-39,2.

10. 隋廣超.大腸桿菌中包含體的形成及其活性表達(dá)產(chǎn)物的分離[J].生物技術(shù).1993,(2).6.