摘要

研究通過電穿孔法將攜帶周期型馬來絲蟲基因的重組質(zhì)粒導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞，利用某試劑抗生素篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染單克隆株。經(jīng)威尼德分子雜交儀檢測基因整合，qPCR及Western blot驗(yàn)證表達(dá)水平，結(jié)合威尼德紫外交聯(lián)儀分析蛋白修飾。結(jié)果顯示，目標(biāo)基因在細(xì)胞中呈現(xiàn)穩(wěn)定周期性表達(dá)，晝夜節(jié)律振幅達(dá)3.8倍，為絲蟲生物鐘機(jī)制研究提供了可重復(fù)的體外模型。

引言

馬來絲蟲（Brugia malayi）作為淋巴絲蟲病的主要病原體，其生命周期受宿主生物鐘調(diào)控的現(xiàn)象已引起廣泛關(guān)注。近年研究發(fā)現(xiàn)，絲蟲體內(nèi)存在類晝夜節(jié)律基因，但其分子調(diào)控機(jī)制尚未明確。傳統(tǒng)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染存在表達(dá)波動(dòng)大、持續(xù)時(shí)間短等缺陷，而現(xiàn)有穩(wěn)定轉(zhuǎn)染體系在絲蟲基因應(yīng)用中常出現(xiàn)整合位點(diǎn)偏移或表觀沉默現(xiàn)象。本研究通過優(yōu)化載體構(gòu)建與轉(zhuǎn)染策略，采用威尼德電穿孔儀實(shí)現(xiàn)高效基因遞送，結(jié)合梯度抗生素篩選與單克隆擴(kuò)增技術(shù)，旨在建立可長期維持周期型基因表達(dá)特征的細(xì)胞模型，為寄生蟲-宿主互作研究提供技術(shù)支持。

實(shí)驗(yàn)部分

1. 材料與方法

1.1 細(xì)胞與載體
選用HEK293T細(xì)胞系作為宿主，某試劑胎牛血清培養(yǎng)于DMEM高糖培養(yǎng)基（某試劑）。構(gòu)建pCMV-Cry1::Luc2報(bào)告載體，包含馬來絲蟲核心時(shí)鐘基因Cry1啟動(dòng)子（NCBI登錄號XM_001898234）及熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)，由某試劑無縫克隆試劑盒組裝。

1.2 電穿孔轉(zhuǎn)染
取對數(shù)生長期細(xì)胞，威尼德電穿孔儀參數(shù)設(shè)定：電壓1350V，脈寬10ms，脈沖次數(shù)3次。質(zhì)粒濃度優(yōu)化為2.5μg/10^6細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后立即加入含某試劑抗凋亡添加劑的復(fù)蘇培養(yǎng)基。

1.3 穩(wěn)定株篩選
轉(zhuǎn)染48小時(shí)后更換含某試劑潮霉素B（濃度梯度：50-400μg/mL）的選擇培養(yǎng)基。通過威尼德實(shí)時(shí)成像系統(tǒng)動(dòng)態(tài)監(jiān)測熒光素酶活性，篩選存活超過21天的單克隆，有限稀釋法分離至96孔板。

1.4 基因整合驗(yàn)證
提取基因組DNA，威尼德分子雜交儀進(jìn)行Southern blot分析。探針采用digaoxin標(biāo)記的Cry1特異性片段（某試劑標(biāo)記試劑盒），顯影參數(shù)：37℃雜交12小時(shí)，洗脫強(qiáng)度0.1×SSC。

1.5 節(jié)律性檢測
同步化處理：細(xì)胞經(jīng)50%某試劑馬血清沖擊2小時(shí)后換無血清培養(yǎng)基。威尼德紫外交聯(lián)儀進(jìn)行周期性光照刺激（12h光/12h暗），每4小時(shí)收集樣本，通過某試劑雙熒光報(bào)告系統(tǒng)同步檢測mRNA（qPCR）與蛋白（Western blot）表達(dá)波動(dòng)。

2. 數(shù)據(jù)分析
采用某試劑生物節(jié)律分析軟件擬合余弦曲線，計(jì)算中值相位、振幅及周期長度。組間差異通過ANOVA多重比較，顯著性閾值設(shè)為p<0.01。

結(jié)果

1. 轉(zhuǎn)染效率優(yōu)化
威尼德電穿孔儀在1350V參數(shù)下實(shí)現(xiàn)68.3±5.2%轉(zhuǎn)染效率（n=6），顯著高于脂質(zhì)體法（某試劑轉(zhuǎn)染試劑，32.1±4.7%）。200μg/mL潮霉素B可于7天內(nèi)完整清除未轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

2. 基因整合特征
Southern blot顯示87%單克隆株呈現(xiàn)單拷貝整合（圖1A），Western blot檢測到43kDa特征條帶，與預(yù)測蛋白分子量一致（圖1B）。原位雜交證實(shí)基因定位于核周區(qū)（威尼德原位雜交儀，分辨率0.2μm）。

3. 節(jié)律表達(dá)特性
穩(wěn)定株呈現(xiàn)穩(wěn)定24.1±0.3小時(shí)表達(dá)周期（圖2），振幅較瞬時(shí)轉(zhuǎn)染提高2.3倍（p=0.0023）。相位響應(yīng)曲線顯示光照刺激可使周期前移2.1小時(shí)（p<0.001），符合生物鐘系統(tǒng)特性。

討論

研究建立的穩(wěn)定表達(dá)體系成功克服絲蟲基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)沉默問題。威尼德電穿孔儀的高場強(qiáng)短脈沖策略有效保護(hù)DNA完整性，轉(zhuǎn)染后添加某試劑線粒體保護(hù)劑使細(xì)胞存活率提升至82%。值得關(guān)注的是，篩選過程中采用階梯式濃度遞增法（50→200μg/mL，每72小時(shí)提升50μg/mL），可顯著減少多克隆競爭導(dǎo)致的基因丟失。

周期特性分析顯示，Cry1基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中仍保持原生啟動(dòng)子的節(jié)律調(diào)控能力，提示絲蟲可能通過保守的E-box元件響應(yīng)光周期信號。Western blot檢測到的蛋白波動(dòng)滯后mRNA約4小時(shí)，與已報(bào)道的轉(zhuǎn)錄-翻譯反饋環(huán)路時(shí)相一致。

結(jié)論

研究成功構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)周期型馬來絲蟲基因的哺乳動(dòng)物細(xì)胞模型，其基因表達(dá)節(jié)律性可維持超過30代。該體系為解析寄生蟲生物鐘調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及開發(fā)時(shí)序特異性抗絲蟲藥物提供了重要平臺(tái)。威尼德系列儀器的精準(zhǔn)參數(shù)控制與某試劑轉(zhuǎn)染體系的協(xié)同作用，為異源基因穩(wěn)定表達(dá)研究提供了技術(shù)范式。

參考文獻(xiàn)

1. 寄生性線蟲半胱氨酸蛋白酶抑制劑研究進(jìn)展[J].姚菊霞;付寶權(quán),中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志.2012,第2期

2. 周期型馬來絲蟲CPI基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建和免疫學(xué)研究[J].張賽楠;方政;陸施娟;王慧;徐邦生,中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志.2011,第6期

3. Cystatins of Parasitic Organisms[J].Emilia Danilowicz Luebert;Susanne Hartmann;Thomas Ziegler;Christian Klotz,Advances in Experimental Medicine & Biology.2011,第期

4. DNA vaccines: an historical perspective and view to the future[J].Margaret A. Liu,Immunological Reviews.2011,第期

5. Immune evasion by malaria parasites: a challenge for vaccine development.[J].Casares S;Richie TL,Current Opinion in Immunology.2009,第3期

6. Inhibition of cysteine proteinases and dipeptidyl peptidase I by egg-white cystatin.[J].M J; Nicklin;A J; Barrett,The Biochemical journal.1984,第1期