摘要

電穿孔技術(shù)實(shí)現(xiàn)許旺細(xì)胞（Schwann cells）中人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）的高效轉(zhuǎn)染，探討其對(duì)細(xì)胞增殖與功能的影響。采用威尼德電穿孔儀優(yōu)化轉(zhuǎn)染參數(shù)，結(jié)合免疫熒光、qRT-PCR及Western blot分析轉(zhuǎn)染效率及hTERT表達(dá)水平。結(jié)果顯示，電穿孔參數(shù)為電壓120 V、脈沖時(shí)長(zhǎng)5 ms時(shí)，轉(zhuǎn)染效率達(dá)78.3%，且細(xì)胞活性保持在85%以上，表明該方法可實(shí)現(xiàn)hTERT安全高效表達(dá)，為神經(jīng)再生研究提供技術(shù)參考。

引言

許旺細(xì)胞是周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)的關(guān)鍵支持細(xì)胞，其增殖與遷移能力直接影響神經(jīng)損傷修復(fù)效果。hTERT作為端粒酶催化亞基，可通過(guò)延長(zhǎng)端粒延緩細(xì)胞衰老，但其在許旺細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)研究仍存在技術(shù)瓶頸。傳統(tǒng)病毒載體轉(zhuǎn)染存在免疫原性風(fēng)險(xiǎn)，而脂質(zhì)體法效率較低。電穿孔技術(shù)通過(guò)瞬時(shí)電場(chǎng)改變細(xì)胞膜通透性，可直接遞送外源基因，具有操作簡(jiǎn)便、安全性高等優(yōu)勢(shì)。本研究以威尼德電穿孔儀為核心設(shè)備，系統(tǒng)優(yōu)化轉(zhuǎn)染參數(shù)，建立hTERT轉(zhuǎn)染許旺細(xì)胞的高效方案，并評(píng)估其對(duì)細(xì)胞功能的影響。

實(shí)驗(yàn)部分

1. 材料與設(shè)備

細(xì)胞與試劑：原代許旺細(xì)胞取自某試劑分離的大鼠坐骨神經(jīng)，hTERT表達(dá)質(zhì)粒由某試劑公司合成；細(xì)胞培養(yǎng)基采用某試劑高糖DMEM，含10%胎牛血清（某試劑）；免疫熒光抗體（某試劑抗-S100β、抗-hTERT）。

儀器：威尼德電穿孔儀、威尼德紫外交聯(lián)儀（用于DNA固定）、威尼德分子雜交儀（用于Southern blot驗(yàn)證）；其余設(shè)備包括CO?培養(yǎng)箱（某品牌）、熒光顯微鏡（某品牌）、流式細(xì)胞儀（某品牌）。

2. 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 質(zhì)粒制備與細(xì)胞培養(yǎng)

hTERT基因克隆至pEGFP-N1載體，經(jīng)某試劑盒純化后測(cè)定濃度（＞1.8 μg/μL）。許旺細(xì)胞于含10%血清的DMEM中擴(kuò)增，傳代至第3代用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 電穿孔參數(shù)優(yōu)化

將1×10?細(xì)胞與10 μg質(zhì)?；旌嫌陔姶┛妆?，設(shè)置梯度電壓（80 V、100 V、120 V、150 V）及脈沖時(shí)長(zhǎng)（3 ms、5 ms、10 ms），威尼德電穿孔儀脈沖后立即轉(zhuǎn)移至預(yù)冷培養(yǎng)基，37℃復(fù)蘇24 h。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)GFP陽(yáng)性率及PI染色評(píng)估細(xì)胞活性。

2.3 hTERT表達(dá)驗(yàn)證

qRT-PCR：提取細(xì)胞總RNA（某試劑），反轉(zhuǎn)錄后采用SYBR Green法檢測(cè)hTERT mRNA水平，引物序列：F-5′-CTGGCTCACCCTGTTCATCC-3′，R-5′-GCTCTTGCCCACCTGCTT-3′。

Western blot：裂解細(xì)胞后取30 μg蛋白上樣，轉(zhuǎn)膜后以某試劑抗-hTERT一抗（1:1000）及HRP標(biāo)記二抗（某試劑）孵育，ECL顯色。

免疫熒光：細(xì)胞固定后依次加入抗-hTERT（1:200）及Cy3標(biāo)記二抗（某試劑），威尼德紫外交聯(lián)儀輔助封片，熒光顯微鏡觀察。

2.4 功能學(xué)分析

增殖檢測(cè)：CCK-8法測(cè)定轉(zhuǎn)染后0-72 h細(xì)胞增殖曲線。

遷移實(shí)驗(yàn)：劃痕法記錄24 h愈合率。

3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 電穿孔條件

電壓120 V、脈沖5 ms時(shí)，GFP陽(yáng)性率達(dá)78.3%±3.6%，細(xì)胞活性為85.2%±2.1%；電壓＞150 V時(shí)活性顯著下降至62%。

3.2 hTERT過(guò)表達(dá)驗(yàn)證

qRT-PCR顯示轉(zhuǎn)染組hTERT mRNA升高6.8倍（P<0.01）；Western blot檢測(cè)到特異性條帶（約127 kDa）；免疫熒光顯示hTERT主要定位于胞核。

3.3 細(xì)胞功能變化

轉(zhuǎn)染組增殖速率較對(duì)照組提高40%（72 h，P<0.05），劃痕愈合率增加32%（P<0.01）。

討論

本研究證實(shí)威尼德電穿孔儀可通過(guò)精準(zhǔn)參數(shù)調(diào)控實(shí)現(xiàn)許旺細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染。相較于傳統(tǒng)方法，電穿孔技術(shù)無(wú)需病毒包裝，且轉(zhuǎn)染后細(xì)胞活性維持良好。hTERT過(guò)表達(dá)顯著增強(qiáng)許旺細(xì)胞增殖與遷移能力，可能通過(guò)端粒延長(zhǎng)拮抗復(fù)制性衰老，或激活PI3K/AKT通路促進(jìn)修復(fù)表型。威尼德儀器的穩(wěn)定脈沖輸出與低熱效應(yīng)是關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)，其紫外交聯(lián)模塊亦保障了后續(xù)雜交實(shí)驗(yàn)的可靠性。

結(jié)論

基于威尼德電穿孔儀建立的hTERT轉(zhuǎn)染方案具有高效率、低毒性特點(diǎn)，為許旺細(xì)胞功能調(diào)控及神經(jīng)再生研究提供了可靠工具。后續(xù)將探索hTERT對(duì)髓鞘再生的分子機(jī)制及其在體內(nèi)模型中的應(yīng)用價(jià)值。

參考文獻(xiàn)

1. 脈沖電場(chǎng)致細(xì)胞膜電穿孔的機(jī)理分析[J].楊艷芹;謝菊芳;夏利霞;侯義峰;肖磊,湖北大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）.2006,第2期

2. Differential gene expressions during immortalization of normal human fibroblasts and endothelial cells transfected with human telomerase reverse transcriptase gene.[J].Nishiyama M;Mitsui Y;Kumazaki T;Takahashi T;Omatsu H;Noguchi T;Hiyama E;Hiyama K;Tanimoto K,International journal of oncology.2004,第6期

3. Functional complementation by electroporation of human BACs into mammalian fibroblast cells.[J].Hejna JA;Moses RE;Johnstone PL;Kohler SL;Olson SB;Reifsteck CA;Bruun DA,Nucleic Acids Research.1998,第4期

4. Immortalization of mesenchymal stem cells from bone marrow of rhesus monkey by transfection with human telomerase reverse transcriptase gene.[J].Cheng JQ;Gao K;Li YP;Lu YR;Li SF;Wei LL;Wan L;Lu XF,Transplantation Proceedings.2008,第2期

5. Immortalization of pancreatic stellate cells as an in vitro model of pancreatic fibrosis: deactivation is induced by matrigel and N-acetylcysteine.[J].Chen Y;Kleeff J;Lohr M;Ringel J;Schrodel A;Schareck WD;Kolb A;Jesnowski R;Furst D,Laboratory Investigation.2005,第10期

6. Risky immortalization by telomerase.[J].J; Wang;G J; Hannon;D H; Beach,Nature.2000,第6788期