一、引言

1. 柔嫩艾美耳球蟲（Eimeria tenella）作為雞球蟲病的主要病原之一，對家禽養殖業造成了極為嚴重的經濟損失。深入理解其生物學特性、致病機制以及開展有效的防控策略研究，在禽病學領域具有極為關鍵的意義。而基因轉染技術作為研究基因功能的重要工具，在柔嫩艾美耳球蟲的研究中也占據著核心地位。

2. 電穿孔轉染技術以其操作相對簡便、轉染效率較高等優勢，在眾多細胞與微生物的基因轉染研究中得到了廣泛應用。然而，對于柔嫩艾美耳球蟲而言，由于其更好的生物學結構和生理特性，常規的電穿孔轉染條件往往難以達到理想的轉染效果。因此，開展針對柔嫩艾美耳球蟲電穿孔轉染條件的優化研究，是當前該領域亟待解決的重要科學問題。這不僅有助于推動柔嫩艾美耳球蟲基礎生物學研究的深入發展，還將為新型抗球蟲藥物和疫苗的研發提供強有力的技術平臺。

二、材料與方法

1. 蟲株與細胞培養

• 柔嫩艾美耳球蟲蟲株：選用實驗室保存的特定株系，該株系具有穩定的生物學特性和遺傳背景，已在前期研究中進行了充分的鑒定和表征。在進行實驗前，通過雞體傳代擴增，確保獲得足夠數量且活力良好的球蟲孢子化卵囊。

• 宿主細胞：采用適宜的雞胚腎細胞（CEK）進行培養。將 CEK 細胞接種于特定的細胞培養瓶中，使用含適量血清、抗生素和營養成分的細胞培養液，在 37°C、5% CO?的培養箱中進行培養。定期觀察細胞生長狀態，當細胞生長至對數生長期時，用于后續的電穿孔轉染實驗。

2. 電穿孔轉染實驗設計

• 電穿孔儀參數設置：選取電壓、脈沖時間和脈沖次數作為主要的電穿孔參數進行優化研究。設置不同的電壓梯度，如 500V、600V、700V 等；脈沖時間設置為 10ms、20ms、30ms 等不同水平；脈沖次數則包括 1 次、2 次、3 次等多種組合。

• 轉染質粒構建：構建含有特定報告基因（如綠色熒光蛋白基因，GFP）的重組質粒，該質粒經過嚴格的設計和構建流程，確保報告基因能夠在柔嫩艾美耳球蟲體內穩定表達且易于檢測。在構建過程中，對質粒的啟動子、終止子等關鍵元件進行優化選擇，以提高基因表達效率。

• 電穿孔轉染操作：將處于合適發育階段（如子孢子期）的柔嫩艾美耳球蟲與適量的重組質粒混合，加入到電穿孔緩沖液中，充分混勻后轉移至電穿孔杯中。按照設定的電穿孔儀參數進行電穿孔操作。電穿孔后，將處理后的球蟲迅速轉移至預熱的細胞培養液中，在適宜條件下繼續培養一定時間，以觀察轉染效果。

3. 轉染效率檢測

• 熒光顯微鏡觀察：在轉染后的不同時間點（如 24 小時、48 小時、72 小時等），利用熒光顯微鏡觀察球蟲體內綠色熒光蛋白的表達情況。通過計數表達熒光的球蟲數量與總球蟲數量的比例，初步評估轉染效率。同時，觀察熒光強度和分布情況，以判斷基因表達的穩定性和均勻性。

• 定量 PCR 檢測：提取轉染后的球蟲總 RNA，反轉錄為 cDNA 后，利用特異性引物對報告基因進行定量 PCR 檢測。通過比較實驗組與對照組中報告基因的相對表達量，進一步精確測定轉染效率。在定量 PCR 實驗中，設置內參基因，以校正實驗誤差，確保結果的準確性和可靠性。

三、結果

1. 電壓對轉染效率的影響

• 當脈沖時間和脈沖次數固定時，隨著電壓的逐漸升高，轉染效率呈現出先上升后下降的趨勢。在較低電壓（如 500V）下，轉染效率相對較低，僅有少量球蟲表達報告基因。隨著電壓升高到 600V 左右時，轉染效率達到峰值，大量球蟲呈現出明顯的綠色熒光，且熒光強度較高。然而，當電壓進一步升高至 700V 及以上時，轉染效率開始下降，同時觀察到球蟲的死亡率明顯增加，細胞形態也出現異常變化。這可能是由于過高的電壓導致球蟲細胞膜受到過度損傷，影響了其正常的生理功能和基因表達調控機制。

2. 脈沖時間對轉染效率的影響

• 在電壓和脈沖次數保持不變的情況下，不同脈沖時間對轉染效率也有著顯著的影響。較短的脈沖時間（如 10ms）下，轉染效率較低，可能是由于脈沖作用時間過短，不足以使質粒充分進入球蟲細胞內。隨著脈沖時間延長至 20ms，轉染效率明顯提高，球蟲體內的熒光信號增強。但當脈沖時間過長（如 30ms）時，轉染效率并未進一步提高，反而略有下降，且球蟲的活力受到一定程度的抑制。這表明過長的脈沖時間可能會對球蟲細胞產生一定的負面影響，如引起細胞內物質的泄漏或細胞膜的不可逆損傷。

3. 脈沖次數對轉染效率的影響

• 當電壓和脈沖時間確定后，改變脈沖次數進行實驗。結果顯示，單次脈沖時轉染效率相對較低，隨著脈沖次數增加到 2 次，轉染效率顯著提高，更多的球蟲成功表達報告基因。但當脈沖次數增加到 3 次及以上時，轉染效率的提升并不明顯，且球蟲的死亡率逐漸上升。這可能是因為過多的脈沖次數會對球蟲細胞造成累積性損傷，盡管在一定程度上增加了質粒進入細胞的機會，但同時也破壞了細胞的生存環境和基因表達體系。

4. 多因素交互作用對轉染效率的影響

• 通過進一步的實驗設計和數據分析，研究發現電壓、脈沖時間和脈沖次數之間存在著復雜的交互作用。例如，在中等電壓（如 600V）和適中脈沖時間（如 20ms）的條件下，適當增加脈沖次數（如 2 次）能夠獲得最佳的轉染效率。而當電壓較高或脈沖時間過長時，增加脈沖次數反而會導致轉染效率下降和球蟲死亡率增加。這種交互作用表明，在優化柔嫩艾美耳球蟲電穿孔轉染條件時，不能僅僅考慮單一因素的影響，而需要綜合考慮多個因素的協同作用，以達到最佳的轉染效果。

四、討論

1. 本研究通過系統地優化柔嫩艾美耳球蟲電穿孔轉染條件，明確了電壓、脈沖時間和脈沖次數等關鍵參數對轉染效率的影響規律。研究結果表明，這些參數之間并非獨立作用，而是存在著復雜的交互關系。在實際應用中，需要根據具體的實驗需求和球蟲的生理狀態，精確調整這些參數，以實現高效、穩定的基因轉染。

2. 與以往的研究相比，本研究在實驗設計和檢測手段上具有一定的創新性。例如，采用了多因素實驗設計方法，全面地分析了各參數之間的交互作用，避免了傳統單因素實驗可能導致的片面性結論。同時，結合熒光顯微鏡觀察和定量 PCR 檢測兩種技術手段，從不同層面準確地評估了轉染效率，提高了結果的可靠性和準確性。

3. 然而，本研究也存在一些不足之處。例如，在實驗過程中僅考慮了電壓、脈沖時間和脈沖次數等電穿孔儀的主要參數，而對于電穿孔緩沖液的成分、球蟲的預處理方式等其他可能影響轉染效率的因素未進行深入研究。此外，本研究僅在體外細胞培養體系中進行了轉染實驗，對于體內環境下的轉染效果及其影響因素還需要進一步探索。在未來的研究中，將進一步拓展研究范圍，綜合考慮更多的因素，完善柔嫩艾美耳球蟲電穿孔轉染技術體系，為球蟲病的深入研究和防控提供更有力的技術支持。