摘要：本文聚焦于蟬新型抗菌肽與人外周血單核細胞（PBMCs）之間的相互作用。詳細描述了 PBMCs 的分離方法、蟬新型抗菌肽的特性，以及將抗菌肽轉(zhuǎn)染至 PBMCs 的實驗流程。通過一系列實驗分析，探討了這種轉(zhuǎn)染對于 PBMCs 功能的影響，包括免疫調(diào)節(jié)、抗菌活性等方面，為開發(fā)新型抗菌免疫療法提供了理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。

一、引言

在當今的醫(yī)學和生物學研究領(lǐng)域，尋找新型抗菌藥物和增強機體自身免疫防御能力是至關(guān)重要的課題。抗菌肽作為天然免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分，具有廣譜抗菌活性和更好的免疫調(diào)節(jié)功能。近年來，從昆蟲中發(fā)現(xiàn)的新型抗菌肽受到了廣泛關(guān)注，其中蟬新型抗菌肽展現(xiàn)出了良好的抗菌潛力。

人外周血單核細胞是免疫系統(tǒng)中的重要細胞成分，參與免疫應答、炎癥反應等多種生理過程。將蟬新型抗菌肽引入人外周血單核細胞，有望賦予這些細胞更強的抗菌能力，并調(diào)節(jié)其免疫功能，為治療細菌感染性疾病和免疫相關(guān)疾病開辟新的途徑。然而，要實現(xiàn)這一目標，首先需要建立穩(wěn)定可靠的人外周血單核細胞分離和轉(zhuǎn)染方法，同時深入了解轉(zhuǎn)染后細胞的生物學特性變化。

二、材料與方法

（一）樣本采集

從健康志愿者（經(jīng)過倫理委員會批準和志愿者知情同意）中采集外周靜脈血，使用含有抗凝劑（如肝素鈉）的真空采血管，采血量一般為 10 - 20ml。采集后，應在 2 - 4 小時內(nèi)進行后續(xù)處理，以保證細胞活性。

（二）人外周血單核細胞（PBMCs）的分離

密度梯度離心法

將采集的血液樣本輕輕顛倒混勻后，緩慢加在淋巴細胞分離液（如 Ficoll - Paque Plus）上，注意保持兩者之間的界面清晰。血液與淋巴細胞分離液的體積比例一般為 2:1。

將離心管置于水平離心機中，以 400 - 800g 的離心力離心 20 - 30 分鐘（離心機升速和降速設(shè)置為低或最慢檔，以避免界面破壞）。離心后，可見血液樣本分層，上層為血漿層，中間白色云霧狀層即為 PBMCs 層，下層為紅細胞和粒細胞沉淀。

使用無菌吸管小心地將 PBMCs 層吸出，轉(zhuǎn)移至新的離心管中。然后用預冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細胞，離心（300 - 500g，10 分鐘），棄去上清液。重復洗滌 2 - 3 次，以去除殘留的淋巴細胞分離液和血漿成分。

磁珠分選法（可選步驟，用于進一步純化）

根據(jù) PBMCs 表面標志物（如 CD14 用于單核細胞）選擇相應的磁珠標記抗體。將洗滌后的 PBMCs 重懸于含有磁珠標記抗體的緩沖液中，在 4℃下孵育 15 - 30 分鐘，使抗體與細胞表面標志物充分結(jié)合。

將孵育后的細胞懸液通過磁場分離柱，標記有磁珠的單核細胞會被吸附在柱上，而其他細胞則流出。然后用緩沖液沖洗分離柱，去除未結(jié)合的細胞。最后將分離柱從磁場中取出，用洗脫液將吸附的單核細胞洗脫下來，得到純化的 PBMCs。

（三）蟬新型抗菌肽的制備與鑒定

抗菌肽的提取與純化
從蟬體組織中提取抗菌肽，可采用勻漿、酸提取、鹽析等方法。例如，將采集的蟬體在液氮中研磨成粉末后，加入酸性緩沖液（如乙酸 - 乙酸鈉緩沖液，pH 4 - 5），在低溫下攪拌提取數(shù)小時。然后通過鹽析（如使用硫酸銨）沉淀蛋白質(zhì)，離心收集沉淀。再利用柱層析技術(shù)（如反相高效液相色譜、離子交換色譜等）進一步純化抗菌肽，通過檢測各洗脫峰的抗菌活性和分析其蛋白質(zhì)譜圖，確定含有抗菌肽的組分。

抗菌肽的鑒定

質(zhì)譜分析：采用質(zhì)譜儀（如 MALDI - TOF - MS、ESI - MS）對純化后的抗菌肽進行分子量測定和氨基酸序列分析。通過與已知的抗菌肽數(shù)據(jù)庫進行比對，初步確定其種類和結(jié)構(gòu)特征。

抗菌活性測定：采用紙片擴散法、微量肉湯稀釋法等檢測抗菌肽對常見病原菌（如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌等）的抑制活性。同時，設(shè)置陽性對照（如已知的標準抗菌藥物）和陰性對照（如緩沖液），以評估抗菌肽的抗菌效能。

（四）抗菌肽轉(zhuǎn)染人外周血單核細胞

轉(zhuǎn)染試劑的選擇
評估多種轉(zhuǎn)染試劑（如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑、陽離子聚合物轉(zhuǎn)染試劑等）對 PBMCs 的適用性。通過比較不同轉(zhuǎn)染試劑在不同濃度下對細胞的毒性（采用細胞活力檢測方法，如 MTT 法、CCK - 8 法）和轉(zhuǎn)染效率（可通過轉(zhuǎn)染帶有熒光標記的抗菌肽模擬物，然后用熒光顯微鏡或流式細胞儀檢測），選擇最佳的轉(zhuǎn)染試劑。

轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化

在選定轉(zhuǎn)染試劑后，優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件。包括轉(zhuǎn)染試劑與抗菌肽的比例、細胞接種密度、轉(zhuǎn)染時間等。例如，在不同的轉(zhuǎn)染試劑與抗菌肽比例（如 1:1、2:1、3:1 等）下，將不同密度（如 1×10?、5×10?、1×10?個 /ml）的 PBMCs 接種于培養(yǎng)板中，在不同的轉(zhuǎn)染時間（如 2、4、6 小時）后檢測轉(zhuǎn)染效率和細胞活性。

轉(zhuǎn)染步驟：將 PBMCs 接種于合適的培養(yǎng)容器（如 24 孔板、6 孔板）中，培養(yǎng)在含有 10% 胎牛血清、1% 青霉素 - 鏈霉素的 RPMI 1640 培養(yǎng)基中，在 37℃、5% CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至合適的細胞狀態(tài)（一般為 70 - 80% 匯合度）。將抗菌肽與轉(zhuǎn)染試劑按照優(yōu)化后的比例在無血清培養(yǎng)基中混合，輕輕渦旋混勻后，室溫下孵育 15 - 30 分鐘，形成轉(zhuǎn)染復合物。然后將轉(zhuǎn)染復合物緩慢滴加到培養(yǎng)的 PBMCs 中，輕輕搖晃培養(yǎng)板使復合物均勻分布。繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在轉(zhuǎn)染后的不同時間點（如 24、48、72 小時）進行后續(xù)分析。

（五）轉(zhuǎn)染后細胞功能檢測

抗菌活性檢測

將轉(zhuǎn)染后的 PBMCs 與不同濃度的病原菌（如細菌懸液，調(diào)整至合適的菌落形成單位，CFU）共培養(yǎng)。在一定時間（如 2 - 24 小時）后，通過菌落計數(shù)法、比濁法等檢測細菌的生長情況，以評估轉(zhuǎn)染抗菌肽后 PBMCs 的抗菌能力。同時設(shè)置未轉(zhuǎn)染抗菌肽的 PBMCs 對照組和單獨病原菌對照組。

采用活 - 死細菌染色法（如使用 SYTO 9 和碘化丙啶混合染料），通過熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染抗菌肽的 PBMCs 對病原菌的殺傷效果，直觀地分辨活細菌（綠色熒光）和死細菌（紅色熒光）。

免疫調(diào)節(jié)功能檢測

細胞因子檢測：采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）或流式細胞術(shù)微球陣列技術(shù)（CBA）檢測轉(zhuǎn)染后 PBMCs 分泌的細胞因子（如白細胞介素 - 1β、白細胞介素 - 6、腫瘤壞死因子 - α 等）的水平變化。收集轉(zhuǎn)染后不同時間點（如 24、48、72 小時）的細胞培養(yǎng)上清液，按照試劑盒說明書進行操作，分析細胞因子分泌量的改變，以評估抗菌肽對 PBMCs 免疫調(diào)節(jié)功能的影響。

免疫細胞表型分析：利用流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染抗菌肽后 PBMCs 表面免疫標志物（如 CD4、CD8、HLA - DR 等）的表達變化。將轉(zhuǎn)染后的細胞用熒光標記的抗體（針對相應的免疫標志物）進行染色，然后通過流式細胞儀分析不同免疫細胞亞群的比例和標志物表達強度的變化，了解抗菌肽對 PBMCs 免疫細胞分化和活化狀態(tài)的作用。

三、結(jié)果

（一）PBMCs 的分離效果

通過密度梯度離心法結(jié)合磁珠分選（如果進行了這一步驟），成功獲得了純度較高的人外周血單核細胞。經(jīng)流式細胞術(shù)檢測，CD14?單核細胞的純度可達 80% - 90% 以上，細胞活力良好，為后續(xù)實驗提供了可靠的細胞來源。

（二）蟬新型抗菌肽的特性

從蟬體組織中成功提取并純化出了新型抗菌肽，質(zhì)譜分析結(jié)果顯示其分子量和氨基酸序列與預期相符，與數(shù)據(jù)庫中已知抗菌肽有一定的相似性但又具有更好的結(jié)構(gòu)特征。抗菌活性測定表明，該抗菌肽對多種測試病原菌具有顯著的抑制作用，其低抑菌濃度（MIC）和低殺菌濃度（MBC）與部分已知抗菌肽相當或更優(yōu)。

（三）轉(zhuǎn)染效率和細胞活性

經(jīng)過對轉(zhuǎn)染試劑和條件的優(yōu)化，確定了最佳的轉(zhuǎn)染方案。在該方案下，轉(zhuǎn)染效率可達到 30% - 50%（通過熒光標記的抗菌肽模擬物檢測），同時細胞活力保持在 70% - 80% 以上（通過 MTT 法檢測）。不同的轉(zhuǎn)染試劑和條件對轉(zhuǎn)染效率和細胞活性有顯著影響，如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑在特定比例下表現(xiàn)出較好的轉(zhuǎn)染效果，但高濃度時會對細胞產(chǎn)生一定毒性。

（四）轉(zhuǎn)染后細胞功能變化

抗菌活性增強
轉(zhuǎn)染蟬新型抗菌肽后的 PBMCs 對病原菌的抗菌能力明顯增強。在與病原菌共培養(yǎng)實驗中，與未轉(zhuǎn)染的對照組相比，轉(zhuǎn)染組能夠顯著降低細菌的生長數(shù)量，且隨著抗菌肽轉(zhuǎn)染量的增加和培養(yǎng)時間的延長，抗菌效果更加顯著。活 - 死細菌染色結(jié)果直觀地顯示了轉(zhuǎn)染抗菌肽的 PBMCs 周圍死細菌數(shù)量增多，表明其對病原菌有直接的殺傷作用。

免疫調(diào)節(jié)功能改變
ELISA 和 CBA 結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染抗菌肽后 PBMCs 分泌的細胞因子水平發(fā)生了變化，部分炎癥相關(guān)細胞因子（如白細胞介素 - 1β、腫瘤壞死因子 - α）在轉(zhuǎn)染后的早期（24 - 48 小時）有一定程度的升高，提示抗菌肽可能激活了 PBMCs 的免疫應答。流式細胞儀分析表明，轉(zhuǎn)染后免疫細胞表面標志物的表達也有改變，如 HLA - DR 的表達上調(diào)，表明 PBMCs 的免疫激活狀態(tài)增強。

四、討論

（一）分離和轉(zhuǎn)染方法的評價

本研究中采用的 PBMCs 分離方法，尤其是密度梯度離心結(jié)合磁珠分選技術(shù)，能夠有效地獲得高純度的單核細胞，但操作過程需要嚴格的無菌技術(shù)和精確的操作技巧，以避免細胞污染和損失。在轉(zhuǎn)染過程中，轉(zhuǎn)染試劑和條件的優(yōu)化是關(guān)鍵步驟。不同的轉(zhuǎn)染試劑對細胞的適用性差異較大，需要綜合考慮轉(zhuǎn)染效率和細胞毒性。本研究確定的最佳轉(zhuǎn)染方案在一定程度上平衡了這兩個因素，但仍有改進的空間，例如進一步探索新型的低毒高效轉(zhuǎn)染試劑或聯(lián)合使用多種轉(zhuǎn)染方法。

（二）抗菌肽對 PBMCs 功能的影響機制

蟬新型抗菌肽轉(zhuǎn)染后增強了 PBMCs 的抗菌活性，這可能是由于抗菌肽本身的直接殺菌作用以及其對 PBMCs 免疫激活的協(xié)同效應。抗菌肽可能通過與 PBMCs 細胞膜上的受體結(jié)合，激活細胞內(nèi)的信號通路，從而促進抗菌物質(zhì)的釋放和免疫細胞的活化。在免疫調(diào)節(jié)方面，抗菌肽誘導的細胞因子分泌變化和免疫標志物表達改變提示其可能參與了免疫細胞的分化和功能調(diào)節(jié)過程，進一步影響了機體的免疫應答。然而，具體的分子機制仍需要深入的研究，例如通過基因表達譜分析、蛋白質(zhì)相互作用研究等方法來闡明抗菌肽在 PBMCs 內(nèi)的作用靶點和信號傳導途徑。

（三）研究的意義和局限性

本研究成功建立了蟬新型抗菌肽人外周血單核細胞分離與轉(zhuǎn)染體系，并初步探討了轉(zhuǎn)染后細胞的功能變化，為開發(fā)基于抗菌肽的新型抗菌免疫療法提供了實驗依據(jù)。這種療法有望在治療細菌感染性疾病，特別是耐藥菌感染方面發(fā)揮積極作用。同時，也為進一步理解抗菌肽與免疫系統(tǒng)的相互作用機制提供了新的視角。然而，本研究也存在一定的局限性，如實驗僅在體外進行，體內(nèi)復雜的生理環(huán)境可能會對轉(zhuǎn)染效果和細胞功能產(chǎn)生影響。此外，對于抗菌肽長期作用下 PBMCs 的安全性和潛在副作用尚未完整明確，需要進一步的體內(nèi)實驗和長期觀察來評估。

五、結(jié)論

綜上所述，我們通過優(yōu)化的方法成功分離了人外周血單核細胞，并實現(xiàn)了蟬新型抗菌肽的有效轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后的 PBMCs 在抗菌活性和免疫調(diào)節(jié)功能方面都有顯著變化。盡管研究存在一定局限性，但本工作為后續(xù)的抗菌肽應用研究和新型抗菌免疫治療策略的開發(fā)奠定了堅實的基礎(chǔ)，為深入探索抗菌肽與免疫系統(tǒng)相互作用機制提供了有價值的參考。未來的研究應進一步完善實驗體系，深入探究其作用機制，并開展體內(nèi)實驗以評估其臨床應用潛力。