天天综合在线观看-天天做人人爱夜夜爽2020-天天做人人爱夜夜爽2020毛片-天天做日日爱-国产成人精品一区二区视频-国产成人精品影视

咨詢熱線

15614103871

當(dāng)前位置:首頁(yè)  >  技術(shù)文章  >  威尼德分子雜交儀:Western試驗(yàn)問(wèn)題歸納與總結(jié)

威尼德分子雜交儀:Western試驗(yàn)問(wèn)題歸納與總結(jié)

更新時(shí)間:2022-07-23      點(diǎn)擊次數(shù):1146

 Q1: PVDF膜和硝酸膜結(jié)合蛋白的原理是什么?

A1:一般而言,硝酸纖維素膜是通過(guò)疏水作用來(lái)和蛋白質(zhì)相聯(lián),若反復(fù)洗幾次后,蛋白容易掉下來(lái),效果較差。尼龍膜主要通過(guò)它膜上的正電荷和蛋白接合(注:常用的PVDF膜即帶正電荷的尼龍膜),同時(shí)也有疏水作用,但相對(duì)較弱。這樣的話,PVDF膜和蛋白接合較牢,不易脫落,效果較好。


    Q2:做組織樣品的western blot的時(shí)候,處理樣品有什么訣竅?

A2: 必須進(jìn)行研磨、勻漿、超聲處理,蛋白質(zhì)溶解度會(huì)更好,離心要充分,膜蛋白需用更劇烈的方法抽提,低豐度膜蛋白可能還要分步抽提(超速離心)。還有一點(diǎn)就是組織中的蛋白酶活性更強(qiáng),需要注意抑制蛋白酶的活性(加入PMSF和蛋白酶抑制劑),封閉劑一般5%脫脂奶粉。如果一抗為多克隆抗體,使用BSA也是不錯(cuò)的選擇

    Q3:免疫組化和Western blot可以用同一種抗體嗎?

A3: 免疫組化時(shí)抗體識(shí)別的是未經(jīng)變性處理的抗原決定簇(又稱表位),有些表位是線性的,而有的屬于構(gòu)象型;線性表位不受蛋白變性的影響,天然蛋白和煮后的蛋白都含有;構(gòu)象型表位由于受蛋白空間結(jié)構(gòu)限制,煮后變性會(huì)消失。如果你所用的抗體識(shí)別的是蛋白上連續(xù)的幾個(gè)氨基酸,也就是線性表位,那么這種抗體可同時(shí)用于免疫組化和Western blotting,而如果抗體識(shí)別構(gòu)象形表位,則只能用于免疫組化。一般抗體說(shuō)明書(shū)上都有注明此種抗體識(shí)別的氨基酸區(qū)間。(限于單抗)

    Q4: 不能很好地將大分子量蛋白轉(zhuǎn)移到膜上, 轉(zhuǎn)移效率低怎么樣解決?

A4: 可以考慮:轉(zhuǎn)移緩沖液中加入20%甲醇(是指終濃度)(優(yōu)化的轉(zhuǎn)移緩沖液,可以參考《蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè)》),因?yàn)榧状伎山档偷鞍踪|(zhì)洗脫效率,但可增加蛋白質(zhì)和NC膜的結(jié)合能力,甲醇可以防止凝膠變形,甲醇對(duì)高分子量蛋白質(zhì)可延長(zhǎng)轉(zhuǎn)移時(shí)間;轉(zhuǎn)移緩沖液加入終濃度0.1%SDS,也是為了增加轉(zhuǎn)移效率;用優(yōu)質(zhì)的轉(zhuǎn)移膜,或使用小孔徑的NC膜(0.2微米);使用戊二醛交聯(lián);低濃度膠,如低至6%。太大時(shí)還可以考慮用瓊脂糖膠;提高轉(zhuǎn)移電壓/電流;增加轉(zhuǎn)移時(shí)間。

    Q5:Western blot哪種染色好?

A5: (1)陰離子染料是常用的,特別是氨基黑,脫色快,背景低檢測(cè)極限可達(dá)到 1.5μg,考馬斯亮藍(lán)雖然與氨基黑有相同的靈敏度,但脫色慢,背景高。麗春紅S和快綠在檢測(cè)后容易從蛋白質(zhì)中除去,以便進(jìn)行隨后的氨基酸分析。缺點(diǎn)是:溶劑系統(tǒng)的甲醇會(huì)引起硝化纖維素膜的皺縮或破壞,不能用于帶正電荷的膜。靈敏度低。

(2)膠體金,靈敏度高,檢測(cè)范圍可到pg級(jí),但染色比較穩(wěn)定。

3)生物素化靈敏度位于1、2之間,可用于任何一種膜。

    Q6: Western檢測(cè)基因轉(zhuǎn)染后細(xì)胞培養(yǎng)上清中表達(dá)的目的蛋白(定性),分子量為20KD,濃度約為幾百ng/ml。蛋白樣品是否需濃縮、純化?如何濃縮、純化上清液中的目的蛋白?對(duì)小分子蛋白Western blot時(shí)需特別注意哪些條件?

A6:按照提供的濃度,如果做Western blot,是不用濃縮樣品的. 對(duì)于20kd的小分子的蛋白,Western Blot中要注意的是:

    1、轉(zhuǎn)移時(shí)的時(shí)間,

    2、轉(zhuǎn)移時(shí)的電流或電壓.

    3、transfer buffer 中加20%的甲醇.

    4、可以用13-15%的分離膠.

    Q7: 半干法轉(zhuǎn)移與膠的面積和蛋白分子兩大小有一定關(guān)系,那么濕法轉(zhuǎn)移是不是所有的轉(zhuǎn)移條件都一樣呢?一般的條件是怎樣的?

A7:半干轉(zhuǎn)的電流大小是按照面積來(lái)算的,時(shí)間是根據(jù)蛋白分子大小定的;而濕轉(zhuǎn)的話電流是恒定的,時(shí)間也是根據(jù)分子量而定。

    Q8: 采用生物素標(biāo)記的二抗-SABC-DAB檢測(cè)系統(tǒng)做western,非特異性的條帶和背景很高,總蛋白考染的時(shí)候發(fā)現(xiàn)接近積層膠的條帶比較清楚,條帶也很窄,可是越靠下面的條帶越來(lái)越寬,有的跑得都連在一起,這是什么原因,如何解決?SDS—PAGE的時(shí)候恒壓和恒流哪個(gè)好?

A8:非特異性的條帶和背景高:可能性很多,如一抗,二抗,封閉的原因都可能??偟鞍卓既镜臅r(shí)候發(fā)現(xiàn)接近積層膠的條帶比較清楚,條帶也很窄,可是越靠下面的條帶越來(lái)越寬,有的跑得都連在一起,這種現(xiàn)象是正常的。另外,也可能積層膠有問(wèn)題。SDS—PAGE的時(shí)候,恒壓和恒流都可以用。

    Q9: 血清樣品進(jìn)行Western blot 分析,目的蛋白21kD,結(jié)果顯色出來(lái)后,目的條帶很淡,而白蛋白和IgG條帶很濃,為什么?

A9:可能是因?yàn)榘椎鞍诪?/span>67kD和目的蛋白相差較大,且其濃度較低,可以底物二氨基聯(lián)苯胺和0.01%過(guò)氧化氫溶液顯色的時(shí)間延長(zhǎng)為30分鐘,再用去離子水漂洗以終止反應(yīng);也可能是抗體的特異性不好。把封閉的時(shí)間延長(zhǎng),同時(shí)提高封閉液的濃度,可以減少以下背景噪音。同時(shí)洗的時(shí)候要*,而目的條帶弱,說(shuō)明濃度不足,如果不考慮后續(xù)功能的話,可過(guò)G-50(細(xì))柱子,純化靶蛋白,接著真空冷凍濃縮,可以得到很好的結(jié)果。

    Q10: Western轉(zhuǎn)膜已經(jīng)成功了,但是Marker泳道未見(jiàn)蛋白條帶,其余各泳道均有清晰的蛋白條帶,經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染膠,結(jié)果相同。經(jīng)5%的脫脂牛奶封閉1小時(shí)45分鐘后,進(jìn)行一抗孵育(1200,建議起始濃度)過(guò)夜,二抗孵育5個(gè)半小時(shí)(1:2000),均在室溫下,DAB顯色,雖出現(xiàn)蛋白條帶,但較弱,且出現(xiàn)非特異性條帶。所用Marker可分離14-116KD的蛋白,是否因?yàn)?/span>marker有問(wèn)題?一抗(多克隆抗體)、二抗的濃度及孵育的時(shí)間是否合適?封閉的時(shí)間是否太短?

A101. marker有可能被降解,也有可能是上樣量太少。

     2. 建議一抗4℃孵育過(guò)夜,稀釋比為1:100;如室溫孵育,兩小時(shí)即可。

     3. 二抗室溫1小時(shí),1:2000,或 4℃封閉過(guò)夜(室溫兩小時(shí)就夠),一抗室溫1小時(shí),二抗室溫1小時(shí),最好是一抗4℃過(guò)夜(或室溫2小時(shí))1:200,二抗室溫1小時(shí)1:2000,換ECL法。

  


爆乳美女午夜福利视频| 无码人妻AⅤ一区二区三区玉蒲团 无码人妻AⅤ一区二区三区用会员 | 国产精品色视频ⅩXXX| 色嗨嗨AV一区二区三区| 被窝影院午夜无码国产| 人妻多毛丰满熟妇av无码| CHINA真实VIDEOS另类| 欧美交换配乱吟粗大免费看| AⅤ日本亚洲欧洲免费| 女M羞辱调教视频网站| 69堂人成无码免费视频果冻传媒| 免费女人高潮流视频在线观看| 中国少妇内射XXXXX-百度| 乱亲女H秽乱长久久久| 岳妇伦丰满69ⅩⅩ| 妺妺窝人体色WWW人体色| 18VIDEOSEX性欧美| 欧美精品亚洲日韩AⅤ| JAPANESEMATURE亲| 人妻中文字幕制服丝袜| 从厨房一路顶撞到卧室门好吗| 日韩一区二区三区无码影院| 国产 浪潮AV性色四虎| 无码AV高潮喷水无码专区线| 国产乱子伦农村叉叉叉| 亚洲AV图片一亚洲AV| 娇妻丁字裤公交车被在线观看| 亚洲精品无码鲁网中文电影| 久久久久久久性潮| 中国另类丰满熟妇乱XXXXX| 妺妺窝人体色WWW精品777| A级黑粗大硬长爽猛出猛进| 人妻少妇HEYZO无码专区| 大胆人体艺术视频| 无码国产精品一区二区高潮| 国产在线 | 传媒麻豆| 亚洲欧美日本中文字不卡| 可以C女性角色的游戏手游| 999国内精品永久免费观看| 人鲁交YAZHONGHUCXX| 丰满人妻妇伦又伦精品国产| 无人码在线观看高清完整免费| 后进式疯狂摇乳无遮挡GIF| 一本一道AⅤ无码中文字幕| 男生女生差差差轮滑免费| 把腿张开老子臊烂h视频| 色综合视频一区中文字幕| 国产精品亚洲精品日韩已满| 亚洲国产精品久久久久4婷婷| 久久婷婷五月综合色和啪| AV区无码字幕中文色| 色偷偷色噜噜狠狠成人免费视频| 国产精品成人嫩草影院| 亚洲国产精品久久久久久久| 麻豆XXXXXX在线观看| 白丝老师用腿夹得我好爽的视频| 熟妇高潮一区二区精品午夜无码 | 九九九精品成人免费视频| 2021日韩无码| 色欲av一区二区三区蜜臀| 国产一区二区三区在线观看免费| 一本大道AV伊人久久综合| 热RE99久久精品国产99热| 国产成人免费无码AV在线播放| 亚洲国产精久久久久久久| 免费无码又爽又刺激毛片| 成人乱婬AV日日摸夜夜爽| 性色AV一区二区三区无码 | 宝贝乖女你的奶真大水真多小说 | 亚洲国产综合无码一区| 免费SM虐女调教网站视频| 粗大的内捧猛烈进出动态图| 亚洲AV人人澡人人爽人人夜夜| 麻豆国产MV视频| 催眠性指导OVA1一6集| 亚洲MV国产MV在线MV综合试| 免费真人视频APP| 国产CHINESE中国HDXX| 亚洲另类无码一区二区三区| 欧美高大丰满FREESEX| 国产精品国产三级国产AV剧情| 亚洲熟妇无码久久精品| 人妻在卧室被老板疯狂进入| 国产色XX群视频射精| 中文在线っと好きだった最新版 | 野花香电视剧全集免费观看高清| 人妻多毛丰满熟妇av无码| 国产亚州精品女人久久久久久| 中国在线观看免费国语版| 少女たちよ在线观看完整版动漫| 久久AV高清无码| 爆乳女教师 高清BD| 亚洲AV伊人久久综合密臀性色| 农村妇女野外交性高清片| 国产精品免费一区二区三区四区 | 37大但人文艺术A级都市天气| 天堂资源とまりせっくす| 久久亚洲精品国产亚洲老地址| 成人亚洲一区二区三区在线 | 69国产成人精品午夜福中文| 无码免费中文字幕视频| 蜜桃av秘 无码一区二区三区| 国产DB624色谱柱36521| 又湿又黄裸乳漫画无遮挡网站| 熟妇高潮一区二区精| 久久一本加勒比波多野结衣| 国产AV无码专区亚洲AVJUL| 一个吃我奶头两个舔我下面| 他将头埋进双腿间吮小核| 乱码人妻Av一区二区三区| 国产高颜值大学生情侣酒店| 中文精品无码中文字幕无码专区| 天天躁夜夜躁AV天天爽| 奶头被几个流浪汉吃肿了| 国产乱码一区二区三区| AV无码爆乳护士在线播放| 亚洲白嫩学生AV无码一区| 日本久久夜夜一本婷婷| 久久久久精品午夜福利| 国产成人无码A区在线观看视频免| 中国熟妇牲交视频| 亚洲AV日韩AV永久无码免下载| 欧美性XXXX狂欢老少配| 精品国产日韩一区二区三区| 成熟人妻视频一区区三区| 玉蒲团之玉女心经| 午夜成人影片在线观看免费完整高| 欧美噜噜久久久XXX| 精品人妻一区二区三区四区| 丰满性熟妇ⅩXXOOOSEX| √天堂资源中文WWW| 亚洲S久久久久一区二区| 三级 丰满 人妻 少妇| 猫咪WWW免费人成网站| 国产午夜激无码AV毛片不| 差差漫画页面免费漫画欢迎你| 亚洲综合大片6999| 性VIDEOS欧美熟妇HDX| 日本精品成人一区二区三区视频 | 国产好爽…又高潮了毛片| IGAO在线视频成人免费| 亚洲中文欧美在线视频 | 欧美大肚子孕妇疯狂作爱视频| 精品人伦一区二区三区潘金莲| 国产超碰人人爽人人做人人添| 99精品国产高清一区二区| 亚洲日韩一页精品发布| 无人高清视频完整版在线观看| 人人妻人人澡人人爽人人| 美女裸体无遮挡免费视频| 黑人又大又粗猛裂进出视频| 国产99视频精品免费视频36| CAOPORN超碰进入页面| 一本色道无码道DVD在线观看| 亚洲AV无码成人影片在线观看| 乳奴调教榨乳器拘束机器| 欧美多人乱大交XXXXX变态亚| 久久久久人妻精品一区蜜桃| 国产无遮挡裸体免费直播 | 亚洲国产精品成人精品无码区在线| 特级毛片A级毛片免费观看网站| 青青草原综合久久大伊人| 麻豆E奶女教师国产精品| 精品一区二区三区波多野结衣 | AV无码AV天天AV天天爽| 影音先锋AⅤ无码资源网| 亚洲卡1卡2乱码新区仙踪| 性少妇JEALOUSVUE成熟| 深入浅出糙汉X软妹V1V| 人与牲动ZZZXXXⅩ0000| 欧美激情精品久久| 蜜桃无码一区二区三区| 久久青草亚洲AV无码麻豆| 精产国品一二三产区别手机| 国产美熟女乱又伦AV果冻传媒| 给丰满少妇按摩到高潮| 超碰97人人射妻| 锕锕锕锕锕WWW湿透了10秒| 69无人区乱码一二三四区别| 诱女偷伦初尝云雨H| 亚洲综合一区自偷自拍| 亚洲日本中文字幕乱码在线电影| 亚洲AV无码一区二区三区蜜桃| 午夜A级理论片在线播放717| 天干天干啦夜天天喷水| 色欲色香天天天综合WWW| 日韩AV高清在线观看| 青青草A免费线观A| 欧美性猛交一区二区| 女人夜夜春高潮爽A∨片传媒| 蜜桃AV无码国产丝袜在线观看| 久久久久亚洲AV无码麻豆 | CAOPORN最新地址| 50岁熟妇大白屁股真爽| 2021国内精品久久久久精免费| 中文字幕乱码人妻综合二区三区| 又色又爽又黄的裸体美女图片 | 天天摸夜夜摸夜夜狠狠摸| 少妇高潮太爽了在线观看欧美| 色噜噜亚洲精品中文字幕|